Plásmido CRISPR de Activación (h) Chitotriosidase: sc-402112-ACT

CHIT1 codifica la quitotriosidasa, una hidrolasa de glucósidos secretada y lisosomal, expresada predominantemente por macrófagos activados y otras células mieloides. Aunque los humanos no sintetizan quitina, CHIT1 participa en las respuestas inmunitarias innatas al reconocer y degradar estructuras que contienen quitina de hongos y parásitos, y se asocia con la polarización de los macrófagos, la función lisosomal y programas de señalización inflamatoria. La expresión alterada de CHIT1 y su actividad enzimática se han relacionado con trastornos caracterizados por activación de macrófagos y remodelado tisular, incluidas enfermedades de almacenamiento lisosomal y afecciones inflamatorias crónicas. Como indicador de la activación mieloide, CHIT1 se estudia con frecuencia en contextos de interacciones huésped–patógeno, inflamación granulomatosa y microambientes fibróticos.

Chitotriosidase El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CHIT1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Chitotriosidase El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CHIT1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CHIT1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Chitotriosidase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CHIT1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Chitotriosidase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Chitotriosidase en células tumorales con expresión de CHIT1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.