Ceramide Kinase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404164-ACT

Das humane CERK-Gen kodiert die Ceramidkinase, eine Lipidkinase, die Ceramid phosphoryliert und dadurch Ceramid-1-phosphat (C1P) erzeugt. Dies verschiebt das Sphingolipid-Gleichgewicht vom proapoptotischen Ceramid hin zu signalkompetenten C1P-Pools. Die CERK-Aktivität unterstützt Membrantransportprozesse und inflammatorische Signalgebung und greift über die Modulation des Sphingolipidstoffwechsels in Signalwege ein, die Zellüberleben, Proliferation und Stressantworten regulieren. Durch die Kontrolle der Ceramid/C1P-Achse beeinflusst CERK Prozesse wie die Eicosanoidproduktion, den vesikulären Transport und die Zytoskelettdynamik. Eine Fehlregulation der CERK-abhängigen Sphingolipid-Signalgebung wurde u. a. im Kontext von Krebsbiologie, Neuroinflammation und metabolischer Dysfunktion beschrieben, wodurch CERK einen relevanten Knotenpunkt für mechanistische Studien zur lipidvermittelten Signalübertragung darstellt.

Ceramide Kinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CERK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ceramide Kinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CERK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CERK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ceramide Kinase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CERK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ceramide Kinase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ceramide Kinase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CERK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.