Cdk5 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-419602-LAC

La chinasi 5 ciclina‑dipendente (Cdk5) è una chinasi serina/treonina diretta verso la prolina che, a differenza delle CDK del ciclo cellulare, viene attivata principalmente da p35/p39 e svolge le sue funzioni in cellule post‑mitotiche. Nei sistemi murini coordina lo sviluppo neuronale, il traffico delle vescicole sinaptiche, la dinamica del citoscheletro e la segnalazione dipendente dall’attività attraverso la fosforilazione di substrati coinvolti nella stabilità dei microtubuli e nella guida assonale. Cdk5 interseca vie che regolano la segnalazione del calcio, la neurotrasmissione dopaminergica e glutamatergica e reti di chinasi sensibili allo stress che influenzano la sopravvivenza e la plasticità neuronale. Un’attività di Cdk5 deregolata è stata associata a fenotipi neurodegenerativi e neuroinfiammatori, a eventi di fosforilazione aberranti e ad alterazioni della funzione dei circuiti rilevanti per modelli di malattia di Alzheimer, malattia di Parkinson, epilessia e dolore neuropatico.

Le particelle di attivazione lentivirale Cdk5 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Cdk5 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Cdk5 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Cdk5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Cdk5. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Cdk5 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.