CCDC89 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408069-ACT

CCDC89 (Coiled-Coil-Domäne enthaltend 89) kodiert ein vorhergesagtes Coiled-Coil-Protein, das mit der Organisation des Zytoskeletts sowie mit Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken in Verbindung gebracht wird, die die intrazelluläre Architektur und Signalübertragung unterstützen. Coiled-Coil-Proteine übernehmen häufig Gerüst-/Scaffold-Funktionen, die die Positionierung von Organellen, den vesikulären Transport und stressresponsive Signalwege beeinflussen; dies legt nahe, dass CCDC89 die räumliche Koordination zellulärer Prozesse modulieren könnte. In Genomik-Datensätzen berichtete Assoziationen auf Expressions- und Variantenebene deuten auf eine mögliche Relevanz von CCDC89 für fehlregulierte Transkriptionsprogramme hin, wie sie in proliferativen und neurobiologischen Kontexten beobachtet werden, und liefern damit eine Motivation für mechanistische Studien in krankheitsrelevanten Zellmodellen. Die Aufklärung, wie CCDC89 die Verschaltung von Signalwegen beeinflusst, kann nachgelagerte Effekte auf Zellzustandsübergänge, Adhäsions-/Migrationsphänotypen und die Proteostase präzisieren.

CCDC89 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCDC89-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CCDC89 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCDC89-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCDC89-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CCDC89-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCDC89-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CCDC89-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CCDC89-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCDC89-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.