Plasmide CRISPR d'Activation (h) CCDC109A: sc-413850-ACT

MCU (CCDC109A) code la sous-unité formant le pore du complexe de l’uniporteur mitochondrial du calcium, permettant l’entrée de Ca2+ à travers la membrane interne mitochondriale afin de coupler les signaux cytosoliques de Ca2+ au métabolisme mitochondrial. En modulant les niveaux de Ca2+ dans la matrice, MCU influence l’activation des déshydrogénases du cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs), l’efficacité de la phosphorylation oxydative, la signalisation par les espèces réactives de l’oxygène et la susceptibilité à la transition de perméabilité en situation de stress. Cet axe du Ca2+ mitochondrial interagit avec la régulation de l’apoptose, l’adaptation bioénergétique et des programmes transcriptionnels dépendants du Ca2+ qui gouvernent la prolifération et la différenciation. Une activité dérégulée de MCU a été mise en cause dans des contextes d’altération de l’état métabolique et des réponses au stress mitochondrial, notamment dans des études sur le remodelage des cellules cancéreuses, les mécanismes des lésions ischémiques et des phénotypes neuromusculaires et neurodégénératifs où l’homéostasie du Ca2+ est perturbée.

CCDC109A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MCU sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CCDC109A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MCU dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MCU, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CCDC109A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MCU natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CCDC109A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CCDC109A dans les cellules tumorales présentant une expression de MCU silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.