Cbp CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401415-ACT

PAG1 kodiert das Csk-bindende Protein (Cbp/PAG1), einen transmembranen Adapter, der in Lipid-Rafts angereichert ist und Signalkomplexe als Gerüstprotein organisiert, um die Aktivität von Src-Familienkinasen durch Rekrutierung von Csk zu dämpfen. Durch die Anordnung phosphorylierter Dockingstellen moduliert Cbp die proximale Signalübertragung am T‑Zell‑Rezeptor und B‑Zell‑Rezeptor, beeinflusst den Signalfluss nachgeschalteter MAPK- und PI3K‑Signalwege und prägt rezeptorabhängige Aktivierungsschwellen. Veränderte PAG1-Expression oder -Phosphorylierung wurde mit dysregulierter Immun-Signalgebung, aberranter Proliferation sowie Veränderungen in Zelladhäsion und -migration in Verbindung gebracht, wodurch es für Studien zur inflammatorischen Signalgebung und zu onkogenen Kinasenetzwerken relevant ist. In menschlichen Zellen fungiert Cbp als zentraler Knotenpunkt, der die Organisation von Membran-Mikrodomänen mit einer kontrollpunktähnlichen Regulation der Tyrosinkinase-Signalgebung verknüpft.

Cbp Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PAG1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cbp Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PAG1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PAG1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cbp-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PAG1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cbp-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cbp-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PAG1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.