Plasmide CRISPR d'Activation (h) cathepsin K: sc-400673-ACT

CTSK code pour la cathepsine K, une protéase cystéine lysosomale dotée d’une forte activité collagénolytique et élastolytique, qui soutient le renouvellement de la matrice extracellulaire et le remodelage tissulaire. Dans les ostéoclastes, la cathepsine K agit au sein de la lacune de résorption pour dégrader le collagène de type I et d’autres protéines de la matrice osseuse, reliant ainsi CTSK à des voies qui régissent la différenciation ostéoclastique, la protéolyse dépendante de l’acidification et l’homéostasie osseuse. Au-delà de la biologie squelettique, l’activité de CTSK est impliquée dans le remodelage matriciel médié par les macrophages et dans des microenvironnements inflammatoires où l’équilibre des protéases influence la migration cellulaire et l’architecture de la niche. Une expression ou une activité dérégulée de CTSK a été associée à des troubles de la densité osseuse et à des phénotypes de remodelage, ainsi qu’à des contextes plus larges touchant le remodelage du tissu conjonctif et du système cardiovasculaire.

cathepsin K Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CTSK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

cathepsin K Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CTSK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CTSK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de cathepsin K. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CTSK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de cathepsin K au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie cathepsin K dans les cellules tumorales présentant une expression de CTSK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.