cathepsin B CRISPR/Cas9 KOプラスミド (m): sc-419873
- 対象生物種: mouse
- 20 µg のトランスフェクション準備済み、精製したプラスミドDNA、～20回トランスフェクション
- cathepsin B CRISPR/Cas9 ノックアウト（KO）プラスミド（m）は、GeCKO v2ライブラリ由来の配列を用いて最大のノックアウト効率を実現するよう設計された、Cas9ヌクレアーゼおよび標的特異的な20塩基対のガイドRNA（gRNA）をそれぞれコードするプラスミドのプールです
- gRNA配列は、Cas9を誘導してcathepsin Bゲノム座において部位特異的な二本鎖切断（DSBs）を引き起こし、非相同末端結合（NHEJ）を介して遺伝子ノックアウトをもたらします
- cathepsin B HDRプラスミド（m）（）（sc-419873-HDR）は、cathepsin B CRISPR/Cas9 KOプラスミド（m）との共トランスフェクションに推奨されます。これにより、HDRを介したプテロマイシン耐性カセットおよびRFPレポーター遺伝子の組み込みを通じて、編集に成功した細胞の選別が可能になります
- cathepsin B HDRプラスミド（m）は、cathepsin B CRISPR/Cas9 KOプラスミド（m）内のgRNA標的部位に対応する相同性依存修復（HDR）テンプレートをそれぞれ含むプラスミドのプールです
- 各HDRプラスミドには、プテロマイシン耐性カセットおよびRFPカセットを挟む2つの約800 bpのホモロジーアームが含まれており、Cas9によって誘導された二本鎖切断部位周辺のゲノムDNA配列に結合し、HDRを介した正確な組み込みを促進するように設計されている
- ピューロマイシン耐性遺伝子とRFP遺伝子はLoxP部位で挟まれているため、安定したノックアウト細胞株を樹立した後、Creリコンビナーゼ（Creベクター：sc-418923）を用いて選択マーカーを除去することができる。
- トランスフェクションの後、遺伝子ノックアウト効果は、抗体を用いたWB、IFまたはIHCによって検定されることができます: cathepsin B 抗体 (H-5): sc-365558
注文情報
| 製品名 | カタログ # | 単位 | 価格 | 数量 | お気に入り | |
cathepsin B CRISPR/Cas9 KOプラスミド (m) | sc-419873 | 20 µg | $397.00 | |||
cathepsin B HDRプラスミド (m) | sc-419873-HDR | 20 µg | $445.00 |
概要
CtsbはカテプシンBをコードしており、カテプシンBはリソソームに局在するシステインプロテアーゼとして細胞内タンパク質の代謝回転を担い、エンドリソソーム輸送、オートファジーとリソソームのクロストーク、抗原プロセシングに寄与します。リソソームにおける典型的な機能にとどまらず、カテプシンBは損傷したリソソームからの漏出や分泌を介して細胞外マトリックスのリモデリングにも関与し、炎症シグナルや組織リモデリングのプログラムと結び付けられています。CTSB活性の変化は、プロテオスタシス、細胞死経路、バリア機能の維持に影響することで、神経変性、腫瘍細胞浸潤、代謝性・炎症性疾患と関連することが報告されています。そのため、マウスCtsbはin vivoおよび細胞ベースの系において、免疫応答のプロテアーゼ依存的制御、細胞外プロテオリシス、ストレス誘導性リソソーム機能障害を解析する目的で広く用いられています。
cathepsin B CRISPR/Cas9 KOプラスミド（m）は、mouse細胞株におけるCtsb遺伝子の標的破壊のために設計されたプラスミドのプールです。このプールに含まれる各プラスミドは、Streptococcus pyogenes Cas9 ヌクレアーゼとともに、Ctsb 遺伝子座内の異なる部位を標的とする固有の sgRNA を共発現し、蛍光による同定と、トランスフェクションに成功した細胞の濃縮を可能にする GFP をコードしています。このマルチガイド戦略は、機能的なノックアウトをもたらすフレームシフトや欠失を誘導する可能性を高め、シングルガイドアプローチに代わる、より堅牢な選択肢を提供します。複数の部位で誘導された二本鎖切断（DSB）は、非相同末端結合（NHEJ）によって修復されるか、または同梱のHDRドナーテンプレートと併用した場合、遺伝子座内の定義された標的部位で相同性依存修復（HDR）によって修復されます。
RFP発現HDRドナーと併用する場合、GFPとRFPの蛍光を併用して、トランスフェクトされた細胞集団と編集された細胞集団を区別できるため、フローサイトメトリーに基づく選別およびクローン選択のワークフローが効率化されます。
相同性依存修復（HDR）ドナー — RFPレポーター付きプロマイシンカセット
確認済みで選択可能なノックアウトクローンを必要とする用途向けに、cathepsin B HDRプラスミド（m）には、定義されたCtsbターゲット部位に特異的なホモロジーアームに挟まれた、プロマイシン耐性カセット（PuroR）および赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーターを含むHDRドナー構築体が含まれています。
cathepsin B CRISPR/Cas9 KOプラスミド（m）と共トランスフェクションした場合：
- PuroR-RFPカセットはHDRを介してCas9切断部位に組み込まれ、Ctsbのオープンリーディングフレームを破壊します。
RFP蛍光は、組み込みの成功を即座に視覚的に示す指標となり、プテロマイシン選別前または選別と並行して、蛍光に基づく編集細胞の同定や選別を可能にします。
編集に成功した細胞はプテロマイシン耐性によって確認されるため、クローンスクリーニングの負担を大幅に軽減します。
この選別戦略は、下流の機能解析、薬剤スクリーニング、またはモデル開発のための安定したクローン性KO細胞株の作製に最適です。
Cre-loxカセット除去システム
このHDRドナー構築体には、PuroR-RFP選択カセットを挟むloxPサイトが組み込まれており、クローンの確認後にマーカーをきれいに除去することが可能です。同梱のCreベクター：sc-418923によるCreリコンビナーゼの一過性発現により、カセットが切除され、Ctsb遺伝子座内に最小限の残留loxPサイトが残るだけで、下流のアッセイに対する潜在的な交絡効果が排除されます。
この2段階のアプローチ：
- 局所的なクロマチン構造および近隣の調節要素への影響を最小限に抑えます
編集された遺伝子座において、ほぼ天然の状態に近いゲノム環境を回復させます
同じ細胞株において、さらなる編集のためにプロマイシン選別戦略を再利用可能にします
主な特徴
- cathepsin Bの機能に不可欠なCtsbエクソンを標的とするgRNA
デリバリーを簡素化するため、SpCas9とsgRNAを単一のプラスミドから共発現
陽性クローン選別用のプロマイシン耐性HDRドナー
シームレスなマーカー除去のためのCreリコンビナーゼベクターを備えたloxPで挟まれたPuroRカセット
トランスフェクションによる導入用に即使用可能な状態で提供
研究用のみ。診断用または治療用ではありません。