Plasmide CRISPR d'Activation (h) CASK: sc-401742-ACT

CASK code une protéine échafaudage de type guanylate kinase associée à la membrane (MAGUK), qui organise des complexes multiprotéiques au niveau des synapses et des jonctions cellule–cellule, en reliant des molécules d’adhérence et des canaux ioniques à des régulateurs de la signalisation et du cytosquelette. Dans les neurones humains, CASK participe au trafic des vésicules synaptiques, à la neurotransmission et à la régulation génique dépendante de l’activité, avec des fonctions liées à la signalisation calcium/calmoduline et aux programmes de polarité jonctionnelle. Une perturbation de la dose ou de la fonction de CASK a été associée à des phénotypes neurodéveloppementaux, notamment une déficience intellectuelle, l’épilepsie et la microcéphalie, ce qui étaye son intérêt en tant que nœud pour étudier l’assemblage synaptique et la maturation neuronale. Ces caractéristiques font de CASK une cible pertinente pour disséquer les voies qui gouvernent la connectivité neuronale, l’excitabilité et les réseaux de signalisation dépendants d’échafaudages.

CASK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CASK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CASK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CASK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CASK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CASK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CASK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CASK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CASK dans les cellules tumorales présentant une expression de CASK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.