CAMK2A/CaMKII alpha CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400228-ACT

CAMK2A kodiert die Alpha-Untereinheit der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase II (CaMKIIα), einer Serin/Threonin-Kinase, die intrazelluläre Calciumtransienten in phosphorylierungsabhängige Signalübertragung übersetzt. In Neuronen ist CaMKIIα stark in postsynaptischen Dichten angereichert, wo sie den synaptischen Vesikelzyklus, das Trafficking von AMPA-Rezeptoren und die aktivitätsabhängige Genexpression reguliert, die synaptischer Plastizität, Lernen und Gedächtnis zugrunde liegt. CAMK2A integriert vorgelagerte Signale aus dem NMDA-Rezeptor-vermittelten Ca2+-Einstrom und ist mit MAPK/ERK- sowie CREB-assoziierten Transkriptionsprogrammen verknüpft. Eine Fehlregulation der CaMKIIα-Signalgebung wurde mit neuroentwicklungsbedingten und neuropsychiatrischen Phänotypen, neurodegenerativen Prozessen und exzitotoxischen Stresspfaden in Verbindung gebracht, weshalb sie ein häufig genutzter Knotenpunkt für mechanistische Studien der neuronalen Funktion ist.

CAMK2A/CaMKII alpha Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CAMK2A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CAMK2A/CaMKII alpha Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CAMK2A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CAMK2A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CAMK2A/CaMKII alpha-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CAMK2A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CAMK2A/CaMKII alpha-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CAMK2A/CaMKII alpha-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CAMK2A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.