Plasmide CRISPR d'Activation (m) Calpastatin: sc-419474-ACT

Mouse Cast code la calpastatine, l’inhibiteur endogène des protéases calpaïnes dépendantes du calcium, qui limite la protéolyse restreinte de substrats du cytosquelette et de la signalisation. En modulant l’activité des calpaïnes, la calpastatine contribue à réguler le remodelage du cytosquelette, le renouvellement des adhésions focales, le trafic membranaire et l’apoptose, avec des effets en aval sur la signalisation inflammatoire et les réponses au stress. L’équilibre CAST–calpaïnes est largement pertinent pour l’intégrité tissulaire dans le muscle et le système nerveux, et sa dérégulation a été associée dans la littérature à des mécanismes impliqués dans la myopathie, la neurodégénérescence et une activation immunitaire altérée. Dans des modèles cellulaires et animaux, la modulation de l’expression de Cast est utilisée pour disséquer des programmes de remodelage pilotés par des protéases et des réseaux de signalisation dépendants du calcium.

Calpastatin Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cast sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Calpastatin Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cast dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cast, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Calpastatin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cast natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Calpastatin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Calpastatin dans les cellules tumorales présentant une expression de Cast silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.