Plásmido CRISPR de Activación (h) C-Nap1: sc-403009-ACT

El CEP250 humano codifica C-Nap1, una proteína centrosomal de tipo *coiled-coil* concentrada en los extremos proximales de los centríolos, donde ayuda a mantener la cohesión del centrosoma y organiza el anclaje de los microtúbulos. C-Nap1 participa en la separación de los centrosomas durante la progresión del ciclo celular mediante una remodelación dependiente de fosforilación, lo que favorece el ensamblaje correcto del huso mitótico, la segregación cromosómica y procesos vinculados a la ciliogénesis. La alteración de la integridad del centrosoma y de la organización de los microtúbulos es ampliamente relevante para fenotipos de inestabilidad cromosómica y se ha asociado con contextos de enfermedades neurodelarrollativas y retinianas, donde la función del centrosoma y de los cilios es crítica. Como resultado, CEP250 se estudia de forma rutinaria en vías que regulan la dinámica del centrosoma, la fidelidad mitótica y la organización del citoesqueleto.

C-Nap1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CEP250 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

C-Nap1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CEP250 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CEP250, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de C-Nap1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CEP250 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de C-Nap1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía C-Nap1 en células tumorales con expresión de CEP250 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.