Plasmide CRISPR d'Activation (h) C/EBP α: sc-400195-ACT

CEBPA code le facteur de transcription C/EBPα, une protéine à fermeture éclair de leucines basique (bZIP) qui régule l’engagement de lignée et la différenciation terminale, en particulier dans les programmes granulocytaires et adipocytaires. En se liant aux motifs CCAAT/enhancer, C/EBPα coordonne des réseaux transcriptionnels contrôlant le freinage du cycle cellulaire, l’expression de gènes métaboliques et la maturation myéloïde, avec des interactions fonctionnelles à l’interface des voies de signalisation des cytokines et des voies de régulation de la chromatine. Une expression altérée de CEBPA ou des mutations sont fréquemment associées à une hématopoïèse perturbée et à des phénotypes de blocage de la différenciation, ce qui en fait une cible largement étudiée dans le contrôle transcriptionnel de l’identité myéloïde. Ces propriétés font de C/EBPα un modèle utile pour étudier les effets de dosage des facteurs de transcription, la logique des enhancers et les transitions d’état de différenciation dans les cellules humaines.

C/EBP α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CEBPA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

C/EBP α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CEBPA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CEBPA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de C/EBP α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CEBPA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de C/EBP α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie C/EBP α dans les cellules tumorales présentant une expression de CEBPA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.