Plasmide CRISPR d'Activation (h) BUBR1: sc-403807-ACT

BUB1B code pour BUBR1, un composant central du point de contrôle d’assemblage du fuseau mitotique, qui sécurise la ségrégation des chromosomes en surveillant l’attachement kinétochore–microtubule et en régulant l’activité de l’APC/C via le complexe de contrôle mitotique. BUBR1 contribue au déroulement temporel de la mitose, à la cohésion des chromatides sœurs et à la correction des erreurs, maintenant ainsi la stabilité du génome lors de la division cellulaire. Un dysfonctionnement de BUB1B/BUBR1 est associé à l’instabilité chromosomique et à l’aneuploïdie, des caractéristiques fréquemment étudiées en cancérologie et dans les troubles du développement affectant le contrôle du cycle cellulaire. En tant que régulateur de checkpoint, BUBR1 est également utilisé comme nœud mécanistique pour étudier les réponses au stress mitotique et les phénotypes dépendants de la prolifération.

BUBR1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BUB1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BUBR1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BUB1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BUB1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BUBR1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BUB1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BUBR1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BUBR1 dans les cellules tumorales présentant une expression de BUB1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.