Plasmide CRISPR d'Activation (h) BUB3: sc-402439-ACT

BUB3 code une protéine essentielle du point de contrôle d’assemblage du fuseau mitotique (SAC), localisée aux kinétochores, qui contribue à surveiller l’attachement des microtubules pendant la mitose. En s’associant à BUB1 et en participant au complexe de contrôle mitotique, BUB3 retarde l’entrée en anaphase en régulant l’activité de l’APC/C et favorise une ségrégation fidèle des chromosomes. Une perturbation de la signalisation du point de contrôle liée à BUB3 peut favoriser l’instabilité chromosomique et l’aneuploïdie, des processus fréquemment étudiés dans les travaux sur la tumorigenèse et le maintien du génome. Par conséquent, BUB3 est largement utilisé comme point d’entrée mécanistique pour étudier la fidélité mitotique, la signalisation au niveau des kinétochores et les réponses au stress dépendantes du cycle cellulaire dans les cellules humaines.

BUB3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BUB3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BUB3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BUB3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BUB3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BUB3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BUB3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BUB3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BUB3 dans les cellules tumorales présentant une expression de BUB3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.