BNPI CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403333-ACT

SLC17A7 kodiert den vesikulären Glutamattransporter BNPI (VGLUT1), ein Membranprotein synaptischer Vesikel, das Glutamat in Vesikel verlädt und damit die quantale Neurotransmitterfreisetzung an exzitatorischen Synapsen ermöglicht. Durch die Kontrolle der präsynaptischen Glutamatverpackung beeinflusst BNPI die synaptische Transmission, aktivitätsabhängige Plastizität sowie das Gleichgewicht zwischen Erregung und Hemmung in neuronalen Netzwerken. Die Funktion von SLC17A7 ist eng mit neuronalen Signalwegen verknüpft, die Lernen und Gedächtnis prägen, darunter Prozesse der Vesikelzyklen, der Neurotransmitter-Homöostase und der Schaltkreis-Erregbarkeit. Veränderte glutamaterge Signalübertragung unter Beteiligung von SLC17A7 wurde im Zusammenhang mit neuroentwicklungsbedingten und neuropsychiatrischen Phänotypen sowie mit Anfallsanfälligkeit und Mechanismen exzitotoxischen Stresses untersucht.

BNPI Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC17A7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BNPI Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC17A7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC17A7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BNPI-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC17A7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BNPI-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BNPI-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC17A7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.