BNIP-3 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419356-ACT

Das Mausgen *Bnip3* kodiert BNIP-3, ein hypoxieinduzierbares, ausschließlich BH3-haltiges Mitglied der BCL2-Familie, das überwiegend an der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert ist und die mitochondriale Homöostase reguliert. BNIP-3 fördert mitochondriale Depolarisation, Mitophagie und programmierten Zelltod über Signalwege, die mit der HIF-1-Signalgebung, dem Autophagosom–Lysosom-Umsatz und der Wechselwirkung mit Apoptoseregulatoren verknüpft sind. In metabolisch gestressten Geweben trägt BNIP-3 dazu bei, das Gleichgewicht zwischen Überleben und der Entfernung geschädigter Mitochondrien fein abzustimmen, und beeinflusst dabei die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies sowie die bioenergetische Anpassung. Eine fehlregulierte BNIP-3-Aktivität wurde in Zusammenhängen wie ischämischen Schäden, Neurodegeneration und Hypoxie im Tumormikromilieu beschrieben, was BNIP-3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Stressanpassung und mitochondrialer Qualitätskontrolle in Mausmodellen macht.

BNIP-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Bnip3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BNIP-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Bnip3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Bnip3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BNIP-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Bnip3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BNIP-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BNIP-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Bnip3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.