Plasmide CRISPR d'Activation (h) BNIP-3: sc-400985-ACT

BNIP3 code BNIP-3, une protéine BH3‑only inductible par l’hypoxie, localisée aux mitochondries, qui régule le contrôle qualité mitochondrial, la mitophagie et les choix de destinée cellulaire liés à la mort. Par ses interactions avec des membres de la famille BCL2 et la machinerie de l’autophagie, BNIP-3 relie la détection de l’oxygène au remodelage de la membrane mitochondriale, à l’adaptation métabolique et à une apoptose répondant au stress ou à une élimination autophagique. BNIP-3 est contrôlée au niveau transcriptionnel par des voies de signalisation de l’hypoxie telles que HIF‑1 et participe aux réponses cellulaires à l’ischémie, à la privation de nutriments et au stress oxydant. Une expression dérégulée de BNIP3 a été associée à des altérations de la biologie de l’hypoxie tumorale, aux réponses au stress des cardiomyocytes et à des processus neurodégénératifs dans lesquels le dysfonctionnement mitochondrial et une mitophagie déficiente contribuent à la pathologie.

BNIP-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BNIP3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BNIP-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BNIP3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BNIP3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BNIP-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BNIP3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BNIP-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BNIP-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de BNIP3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.