Bax CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400042-ACT

Human BAX kodiert Bax, einen proapoptotischen Effektor der BCL-2-Familie, der die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran und die Freisetzung von Cytochrom c steuert und dadurch die Caspase-Aktivierung sowie die intrinsische Apoptose einleitet. Die Bax-Aktivität wird durch BH3-only-Proteine reguliert und durch antiapoptotische BCL-2-Mitglieder ausgeglichen; so werden zelluläre Stresssignale wie DNA-Schäden und Entzug von Wachstumsfaktoren integriert. Dieser Signalweg überschneidet sich mit p53-abhängigen Stressantworten, der mitochondrialen Dynamik und der Proteostase und prägt so Entscheidungen über das Zellschicksal. Eine fehlregulierte BAX-Expression oder -Signalübertragung trägt zu veränderten Apoptoseschwellen bei, wie sie in der Krebsbiologie, bei Neurodegeneration und in der Immunhomöostase beobachtet werden, wodurch BAX einen zentralen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Kontrolle des Zelltods darstellt.

Bax Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BAX-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Bax Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BAX-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BAX-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Bax-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BAX-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Bax-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Bax-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BAX-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.