ATP6H CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411234-ACT

ATP6V0E1 kodiert ATP6H, eine zentrale Komponente der V0-Domäne der vakuolären H⁺-ATPase (V-ATPase), die den für die Ansäuerung von Endosomen, Lysosomen und sekretorischen Vesikeln erforderlichen Protonentransport antreibt. Durch die Kontrolle des pH-Werts von Organellen reguliert die V-ATPase-Aktivität die rezeptorvermittelte Endozytose, Proteinsortierung und -degradation, den autophagischen Flux sowie den Membrantransport im Zusammenhang mit mTOR- und lysosomenabhängiger Signalgebung. Störungen von V-ATPase-Untereinheiten beeinträchtigen die vesikuläre Homöostase und können die Antigenprozessierung, die Beladung von Neurotransmittern und den zellulären Stoffwechsel verändern. Eine dysregulierte Vesikelansäuerung und lysosomale Funktion sind an der Anpassung von Krebszellen, neurodegenerativen Phänotypen und Immunfunktionsstörungen beteiligt, was ATP6V0E1 zu einem nützlichen Ansatzpunkt für die Untersuchung endolysosomaler Signalwege macht.

ATP6V0E1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP6V0E1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATP6V0E1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP6V0E1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP6V0E1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATP6V0E1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP6V0E1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATP6V0E1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATP6V0E1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP6V0E1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.