ATG7 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-428805-ACT

Das murine Atg7-Gen kodiert ATG7, ein E1-ähnliches Enzym, das ubiquitinähnliche Konjugationsreaktionen katalysiert, die für die Bildung von Autophagosomen essenziell sind. ATG7 aktiviert ATG12 sowie Proteine der LC3/Atg8-Familie, um die Ausdehnung des Phagophors, die Sequestrierung von Fracht und den autophagischen Fluss voranzutreiben, und verknüpft damit Nährstoffsensorik mit lysosomalem Turnover. Über seine zentrale Rolle in der Makroautophagie beeinflusst ATG7 die mitochondriale Qualitätskontrolle, die Proteostase und die angeborene Immun-Signalübertragung; seine Dysregulation wird häufig genutzt, um autophagieabhängige Phänotypen in Neurodegeneration, metabolischem Stress, Infektionsbiologie und krebsrelevanter zellulärer Adaptation zu modellieren. In Mausmodellen wird die Perturbation von Atg7 breit eingesetzt, um das Crosstalk mit der mTOR/AMPK-Signalgebung, ER-Stressantworten und inflammationsassoziierten Transkriptionsprogrammen zu untersuchen.

ATG7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Atg7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATG7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Atg7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Atg7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATG7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Atg7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATG7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATG7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Atg7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.