ATF-6α CRISPR Activation Plasmid (m): sc-432646-ACT

ATF6 (aktivierender Transkriptionsfaktor 6 alpha) ist ein in der ER-Membran verankerter bZIP-Transkriptionsfaktor, der als zentraler Sensor der Unfolded-Protein-Response (UPR) fungiert. Bei ER-Stress transloziert ATF-6α zum Golgi-Apparat, wo es durch regulierte intramembranäre Proteolyse gespalten wird. Dabei wird ein aktives N‑terminales Fragment freigesetzt, das Gene induziert, die an der Proteostase, dem ER-assoziierten Abbau (ERAD) und der chaperonvermittelten Proteinfaltung beteiligt sind. Das ATF6-Signalnetzwerk ist mit den PERK–eIF2α- und IRE1–XBP1-Zweigen verknüpft, um die Anpassung an sekretorische Belastung, oxidativen Stress und metabolische Signale zu koordinieren. Eine fehlregulierte ATF6-Aktivität wird mit Erkrankungen in Verbindung gebracht, die durch chronischen proteotoxischen Stress gekennzeichnet sind, darunter Neurodegeneration, diabetesbedingte β‑Zell-Dysfunktion, entzündliche Zustände und Kardiomyopathie, was ATF6 zu einem wertvollen Knotenpunkt für mechanistische Studien in Mausmodellen macht.

ATF-6α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Atf6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATF-6α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Atf6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Atf6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATF-6α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Atf6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATF-6α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATF-6α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Atf6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.