Ataxin-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417498-ACT

ATXN3 codifica a ataxina-3, uma enzima desubiquitinante que edita cadeias de ubiquitina e ajuda a regular o controlo de qualidade das proteínas através do sistema ubiquitina–proteassoma e de vias ligadas à autofagia. A ataxina-3 participa na proteostase e nas respostas celulares ao stress ao modular a estabilidade e a degradação de substratos mal dobrados ou propensos à agregação, com ligações funcionais à regulação transcricional e à sinalização associada a danos no DNA. A expansão de tratos de poliglutaminas em ATXN3 está associada à ataxia espinocerebelosa tipo 3 (doença de Machado–Joseph), uma doença neurodegenerativa caracterizada por agregação proteica e vulnerabilidade neuronal. Estas propriedades tornam o ATXN3 um alvo útil para estudar a sinalização por ubiquitina, a biologia dos agregados e as vias que governam a homeostase neuronal.

Ataxin-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATXN3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ataxin-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATXN3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATXN3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ataxin-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATXN3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ataxin-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ataxin-3 em células tumorais com expressão de ATXN3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.