Plásmido CRISPR de Activación (m) ASPP1: sc-423473-ACT

El gen murino Ppp1r13b codifica ASPP1, un regulador conservado de la familia p53 que potencia programas de transcripción específicos de secuencia que controlan la apoptosis, la detención del ciclo celular y las respuestas al daño del ADN. ASPP1 modula el equilibrio entre señales de supervivencia y de muerte al influir en la selección de genes diana de p53, p63 y p73, y coopera con vías sensibles al estrés que configuran la homeostasis y la diferenciación epiteliales. A través de estas funciones, la alteración de la actividad de ASPP1 es relevante en modelos experimentales de supresión tumoral, inestabilidad genómica y remodelación dependiente del contexto de las decisiones sobre el destino celular. Por lo tanto, Ppp1r13b constituye un nodo útil para diseccionar mecanismos de control transcripcional que conectan la detección del estrés celular con la muerte celular programada.

ASPP1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ppp1r13b sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ASPP1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ppp1r13b en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ppp1r13b, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ASPP1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ppp1r13b y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ASPP1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ASPP1 en células tumorales con expresión de Ppp1r13b silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.