ASPP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404330-ACT

PPP1R13B kodiert ASPP1, einen prolinreichen Regulator, der an Mitglieder der p53-Familie bindet und Transkriptionsprogramme moduliert, die Apoptose, Zellzyklusarrest und zelluläre Stressantworten steuern. ASPP1 wirkt an der Schnittstelle zwischen der DNA-Schadenssignalgebung und der chromatinassoziierten Transkriptionskontrolle und beeinflusst so das Gleichgewicht zwischen Überleben und programmiertem Zelltod. Eine veränderte PPP1R13B-Expression oder eine durch ASPP1 vermittelte Regulation wurde mit einer fehlregulierten Aktivität des p53-Signalwegs in Verbindung gebracht, wie sie in unterschiedlichen krebsrelevanten Kontexten und auch bei anderen Erkrankungen mit gestörter Apoptosekontrolle beobachtet wird. Daher wird PPP1R13B/ASPP1 häufig in Signalwegen untersucht, die genotoxischen Stress, Tumorsuppressor-Netzwerke und transkriptionelles Remodeling miteinander verknüpfen.

ASPP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP1R13B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASPP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP1R13B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP1R13B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASPP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP1R13B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASPP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASPP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP1R13B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.