Plásmido CRISPR de Activación (h) ARF3: sc-402706-ACT

El factor de ADP-ribosilación 3 (ARF3) es una pequeña GTPasa de la familia ARF que regula el tráfico de membranas al alternar entre los estados unidos a GDP y a GTP para controlar la gemación de vesículas, el reclutamiento de proteínas de la cubierta y el metabolismo de fosfolípidos. ARF3 contribuye a la dinámica del transporte en el Golgi y los endosomas, influyendo en la clasificación de la carga, la secreción y el reciclaje de receptores, que moldean la transducción de señales y la composición de la superficie celular. A través de sus funciones en el transporte intracelular y la coordinación del citoesqueleto, una actividad alterada de ARF3 puede afectar procesos como la proliferación, la migración y las respuestas al estrés. La desregulación del tráfico mediado por ARF se ha asociado con fenotipos relevantes para enfermedades en contextos oncológicos y neurológicos, lo que respalda a ARF3 como un nodo mecanístico para estudiar la logística celular aberrante.

ARF3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ARF3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ARF3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ARF3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ARF3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ARF3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ARF3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ARF3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ARF3 en células tumorales con expresión de ARF3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.