Plasmide CRISPR d'Activation (h) Apg-1: sc-403942-ACT

HSPA4L code Apg-1, un membre de la famille HSP70 de chaperons moléculaires ATP-dépendants qui soutient la protéostasie en favorisant le repliement des protéines clientes, en empêchant leur agrégation et en facilitant la récupération après un stress cellulaire. Apg-1 est impliquée dans les réponses cytoprotectrices au choc thermique et dans la coordination des voies de contrôle qualité liées au renouvellement via le système ubiquitine–protéasome et à l’autophagie, contribuant ainsi au maintien de l’homéostasie protéique lors de stress oxydatif, thermique et du réticulum endoplasmique (RE). Comme le déséquilibre de la protéostasie est une caractéristique fréquente du cancer, des maladies neurodégénératives et d’autres pathologies associées au stress, les modifications de l’activité de HSPA4L sont étudiées dans des contextes où la capacité des chaperons, le mauvais repliement des protéines et l’adaptation au stress influencent les décisions de destinée cellulaire. Apg-1 humaine constitue aussi un modèle utile pour analyser les interactions au sein du réseau HSP70 avec des nœuds de signalisation qui relient la détection du stress à l’apoptose, au contrôle du cycle cellulaire et au remodelage métabolique.

Apg-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HSPA4L sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Apg-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HSPA4L dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HSPA4L, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Apg-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HSPA4L natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Apg-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Apg-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de HSPA4L silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.