ANKFN1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406947-ACT

L’ANKFN1 umano codifica una proteina contenente ripetizioni di anchirina e un dominio di tipo III della fibronectina, ritenuta in grado di supportare interazioni proteina–proteina e funzioni di scaffolding che influenzano l’organizzazione subcellulare e le dinamiche di segnalazione. Sebbene il gene rimanga caratterizzato in modo incompleto, l’architettura dei domini suggerisce potenziali ruoli nel coordinamento di processi associati al citoscheletro e di complessi regolatori che modulano le risposte cellulari a stress e segnali di differenziamento. Studi trascrittomici e genomici hanno riportato alterazioni dell’espressione di ANKFN1 o segnali di associazione in alcuni fenotipi neurologici e dello sviluppo, evidenziandolo come candidato per indagini meccanicistiche. Definire le reti di interazione dipendenti da ANKFN1 e i programmi trascrizionali a valle può contribuire alla mappatura delle vie di segnalazione in modelli cellulari rilevanti per lo sviluppo dei tessuti e la biologia delle malattie.

ANKFN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ANKFN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ANKFN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ANKFN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ANKFN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ANKFN1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ANKFN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ANKFN1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ANKFN1 nelle cellule tumorali con espressione di ANKFN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.