AMPKγ2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404970-ACT

PRKAG2 kodiert die regulatorische AMPKγ2-Untereinheit der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK), einem zentralen Energiesensor, der den zellulären AMP/ATP-Status mit metabolischer Anpassung verknüpft. Durch die Modulation der Assemblierung des AMPK-Komplexes und der Nukleotidwahrnehmung beeinflusst AMPKγ2 nachgeschaltete Signalwege, die über Knotenpunkte wie mTORC1 und ULK1 die Glukoseaufnahme, die Fettsäureoxidation, die mitochondriale Biogenese und die Autophagie steuern. PRKAG2 ist für die Bioenergetik von Herz- und Skelettmuskel von hoher Relevanz, da eine veränderte AMPK-Signalisierung die Substratnutzung und Stressantworten verschieben kann. Genetische Variationen oder eine Fehlregulation von PRKAG2 wurden mit kardialen Erregungsleitungs- und Hypertrophie-Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Eignung für mechanistische Studien zum metabolischen und elektrophysiologischen Remodeling unterstreicht.

AMPKγ2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKAG2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AMPKγ2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKAG2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKAG2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AMPKγ2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKAG2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AMPKγ2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AMPKγ2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKAG2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.