Plásmido CRISPR de Activación (h) Amphiphysin I: sc-403904-ACT

AMPH codifica la anfifisina I, un adaptador endocítico con dominio BAR que detecta e induce la curvatura de la membrana y coordina la endocitosis mediada por clatrina. Interactúa con la dinamina y otros socios con dominio SH3 para regular el reciclaje de vesículas sinápticas, el tráfico de membranas y la remodelación ligada a actina en las terminales presinápticas. A través de su función en la gemación y el reciclaje de vesículas, la anfifisina I contribuye a la homeostasis de la señalización neuronal y se estudia con frecuencia en vías que gobiernan la transmisión sináptica y la dinámica de los endosomas. Las alteraciones en la expresión o la función de AMPH se han investigado en el contexto de la neurobiología y de los mecanismos de enfermedades neurodegenerativas, donde son prominentes los defectos de tráfico y de mantenimiento sináptico.

Amphiphysin I El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de AMPH sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Amphiphysin I El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus AMPH en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional AMPH, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Amphiphysin I. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo AMPH y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Amphiphysin I en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Amphiphysin I en células tumorales con expresión de AMPH silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.