ALY CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403711-ACT

Humanes **ALYREF** codiert **ALY**, einen RNA-bindenden Adapter des **TREX-Komplexes**, der die kotranskriptionelle mRNA-Prozessierung mit dem nukleären Export koppelt. ALY koordiniert die Rekrutierung des Exportrezeptors **NXF1/TAP** und ist an spliceosomenassoziierten Schritten beteiligt, die eine effiziente Reifung und den Transport polyadenylierter Transkripte sicherstellen, wodurch Transkription, Spleißen und Export miteinander verknüpft werden. Aufgrund seiner Funktionen im RNA-Stoffwechsel und in der genomweiten Kontrolle der Genexpression wird ALYREF häufig in Signalwegen untersucht, die Zellproliferation, Differenzierung und Stressantworten steuern. Eine Fehlregulation des TREX-abhängigen mRNA-Exports und der ALYREF-Expression wurde in mehreren Krebskontexten sowie bei anderen Erkrankungen mit veränderter RNA-Prozessierung beschrieben, was mechanistische Studien dazu motiviert, wie Exportfaktoren krankheitsassoziierte Transkriptome prägen.

ALY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ALYREF-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ALY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ALYREF-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ALYREF-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ALY-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ALYREF-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ALY-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ALY-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ALYREF-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.