Plásmido CRISPR de Activación (h) aggrecan: sc-400760-ACT

ACAN codifica el agrecano, un gran proteoglucano de sulfato de condroitina que constituye un componente estructural principal de la matriz extracelular del cartílago. El agrecano interactúa con el hialuronano y la proteína de enlace para formar agregados de alto peso molecular que proporcionan presión osmótica de hinchamiento y resistencia a la carga en el cartílago articular, influyendo en la mecanotransducción de los condrocitos y en la homeostasis de la matriz. La expresión y el recambio de ACAN están estrechamente acoplados a la organización de la matriz extracelular, la biosíntesis de glucosaminoglucanos y la remodelación proteolítica mediada por agrecanasas como miembros de la familia ADAMTS. La síntesis desregulada de agrecano o su escisión acelerada se asocia con la degeneración del cartílago y con alteraciones del desarrollo esquelético, lo que convierte a ACAN en un gen clave para estudiar la biología de los condrocitos y el catabolismo de la matriz.

aggrecan El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ACAN sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

aggrecan El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ACAN en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ACAN, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de aggrecan. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ACAN y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de aggrecan en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía aggrecan en células tumorales con expresión de ACAN silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.