Plasmide CRISPR d'Activation (h) AFP/Alpha fetoprotein: sc-400355-ACT

AFP code l’alpha-fœtoprotéine, une glycoprotéine sécrétée oncofœtale majeure, produite principalement par le foie fœtal et le sac vitellin, puis dont l’expression est réprimée après la naissance. L’AFP contribue aux programmes du développement en favorisant la différenciation des hépatoblastes et en modulant des signaux extracellulaires qui influencent la prolifération et la survie. Dans les tissus adultes, la réexpression aberrante d’AFP est associée à une dédifférenciation de la lignée hépatocellulaire et à des états transcriptionnels altérés observés dans les cancers du foie et des troubles hépatiques connexes. En tant que protéine sécrétée de type biomarqueur, l’AFP est fréquemment utilisée pour étudier le développement hépatique, les transitions d’état cellulaire dans le foie et les phénotypes sécrétoires associés aux tumeurs.

AFP/Alpha fetoprotein Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AFP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AFP/Alpha fetoprotein Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AFP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AFP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AFP/Alpha fetoprotein. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AFP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AFP/Alpha fetoprotein au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AFP/Alpha fetoprotein dans les cellules tumorales présentant une expression de AFP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.