Plasmide CRISPR d'Activation (h) ADSL: sc-404936-ACT

L’ADSL humain code l’adénylosuccinate lyase, une enzyme bifonctionnelle de la biosynthèse de novo des purines qui catalyse le clivage de l’adénylosuccinate en AMP et fumarate, ainsi que la conversion du SAICAR en AICAR. Par ces réactions, l’ADSL contribue à l’homéostasie des nucléotides et relie le métabolisme des purines au métabolisme central du carbone via la production de fumarate, influençant la prolifération cellulaire et l’équilibre énergétique. Une perturbation de l’activité de l’ADSL dérègle les pools de nucléotides puriques et peut modifier la signalisation métabolique liée au contrôle de la croissance. Des variants d’ADSL sont associés au déficit en adénylosuccinate lyase, un trouble métabolique caractérisé par l’accumulation de succinylpurines, avec des effets en aval sur le neurodéveloppement et la physiologie systémique.

ADSL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADSL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ADSL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADSL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADSL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ADSL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADSL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ADSL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ADSL dans les cellules tumorales présentant une expression de ADSL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.