ADO CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-408985-ACT-2

Humanes ADO (2-Aminoethanthiol-Dioxygenase) ist ein nicht-hämhaltiges Eisenenzym, das die sauerstoffabhängige Oxidation von Cysteamin zu Hypotaurin katalysiert und damit die zelluläre Taurinbiosynthese sowie den umfassenderen Stoffwechsel schwefelhaltiger Aminosäuren unterstützt. Indem der Cysteaminumsatz mit Redox- und mitochondrialer metabolischer Homöostase verknüpft wird, überschneidet sich die ADO-Aktivität mit Signal- und Stoffwechselwegen, die oxidativen Stressantworten und die bioenergetische Anpassung in metabolisch aktiven Geweben regulieren. Eine Dysregulation des Taurin/Hypotaurin-Gleichgewichts und des Thiolstoffwechsels wurde mit Erkrankungen in Verbindung gebracht, die mit mitochondrialer Dysfunktion und einer veränderten Handhabung reaktiver Sauerstoffspezies einhergehen, wodurch ADO ein nützliches Ziel für mechanistische Studien darstellt. Durch Geneditierung oder gezielte Perturbation von ADO können Forschende den Stofffluss cysteaminabgeleiteter Metabolite, die Biologie eisenabhängiger Dioxygenasen und die nachgeschalteten Auswirkungen auf zelluläre Stressphänotypen in relevanten humanen Modellsystemen untersuchen.

ADO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADO-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ADO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADO-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADO-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ADO-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADO-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ADO-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ADO-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADO-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.