ADAM10 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400883-ACT

ADAM10 kodiert eine membranverankerte Metalloprotease aus der ADAM-Familie (a disintegrin and metalloprotease), die als wichtigste α‑Sekretase für das Ektodomänen‑Shedding zahlreicher Zelloberflächenproteine fungiert. Durch die Prozessierung von Substraten wie NOTCH‑Rezeptoren/-Liganden, Cadherinen, Zytokinrezeptoren und dem Amyloid‑Vorläuferprotein beeinflusst ADAM10 Zellschicksalsentscheidungen, Adhäsion, Migration und inflammatorische Signalgebung in verschiedenen Geweben. Die von ADAM10 vermittelte Proteolyse moduliert die Dynamik der Notch‑Signalübertragung und die Verfügbarkeit membranständiger Rezeptoren und prägt damit nachgeschaltete Transkriptionsprogramme sowie die interzelluläre Kommunikation. Eine fehlregulierte ADAM10‑Aktivität wird mit pathologischen Umbauprozessen von Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, die an Neurodegeneration, Krebsbiologie und Immunfehlregulation beteiligt sind, und stellt daher ein geeignetes Ziel für mechanistische Studien zur proteaseabhängigen Kontrolle von Signalwegen dar.

ADAM10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADAM10-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ADAM10 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADAM10-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADAM10-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ADAM10-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADAM10-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ADAM10-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ADAM10-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADAM10-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.