ACOT8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407262-ACT

Humanes ACOT8 kodiert eine peroxisomale Acyl‑Coenzym‑A‑Thioesterase, die Acyl‑CoA‑Ester zu freien Fettsäuren und CoA hydrolysiert und so dazu beiträgt, Acyl‑CoA‑Pools auszubalancieren und die Verfügbarkeit von CoA aufrechtzuerhalten. Durch die Regulation der peroxisomalen Lipidverarbeitung beeinflusst ACOT8 die Fettsäure‑β‑Oxidation, das Lipid‑Remodeling sowie die Redox‑Homöostase, die mit der wasserstoffperoxidproduzierenden peroxisomalen Stoffwechselaktivität verknüpft ist. Die ACOT8‑Aktivität greift in übergeordnete Stoffwechselprogramme ein, die den Peroxisom‑Mitochondrien‑Crosstalk und zelluläre Antworten auf Nährstoff‑ und oxidativen Stress koordinieren. Eine veränderte peroxisomale Lipidmetabolisierung und CoA‑Homöostase sind für metabolische Fehlfunktionen und die Biologie peroxisomenassoziierter Erkrankungen relevant, was den Einsatz von ACOT8 als Ziel in Studien zu lipidgetriebenen zellulären Phänotypen unterstützt.

ACOT8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACOT8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ACOT8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACOT8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACOT8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ACOT8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACOT8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ACOT8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ACOT8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACOT8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.