γENaC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402577-ACT

SCNN1G kodiert die γ‑Untereinheit des epithelialen Natriumkanals (γENaC), eines heterotrimeren, amiloridempfindlichen Kanals, der den elektrogenen Na⁺‑Einstrom über apikale Membranen in Niere, Lunge, Kolon und anderen Epithelien vermittelt. Die Funktion von γENaC ist mit der Signalübertragung durch Aldosteron und Vasopressin verknüpft und reguliert den transepithelialen Salz‑ und Wassertransport, was das Volumen der extrazellulären Flüssigkeit, die Homöostase der Flüssigkeitsschicht an der Atemwegsoberfläche und die systemische Elektrolytbalance beeinflusst. Die Kanalaktivität wird durch proteolytische Prozessierung, ubiquitinabhängigen Transport über NEDD4‑2 sowie zelluläre Signalwege gesteuert, die Membranverweildauer und Öffnungswahrscheinlichkeit regulieren. Eine Fehlregulation von ENaC‑Untereinheiten, einschließlich SCNN1G, ist an Störungen der Salzhandhabung und der Hydratation der Atemwege beteiligt und untermauert mechanistische Untersuchungen in der Epithelphysiologie und der Biologie des Ionentransports.

γENaC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SCNN1G-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

γENaC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SCNN1G-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SCNN1G-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen γENaC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SCNN1G-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von γENaC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des γENaC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SCNN1G-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.