Plasmide CRISPR d'Activation (h) γB-crystallin: sc-402939-ACT

CRYGB code la γB-cristalline humaine, une protéine structurale du cristallin de l’œil très abondante et à longue durée de vie, qui contribue à l’indice de réfraction et à la transparence optique grâce à un empaquetage protéique dense mais soluble. En tant que membre de la superfamille des β/γ-cristallines, la γB-cristalline soutient l’homéostasie des cellules des fibres du cristallin en maintenant la stabilité des protéines et en résistant à l’agrégation dans des conditions de stress oxydatif et osmotique. La perturbation de la protéostasie des cristallines est liée à la formation d’agrégats diffusant la lumière et à l’opacification du cristallin, et des variants de CRYGB ont été associés à des phénotypes de cataracte héréditaire. Par conséquent, CRYGB est largement utilisé pour étudier le développement du cristallin, le repliement/l’agrégation des protéines et les voies sensibles au stress qui influencent la transparence.

γB-crystallin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CRYGB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

γB-crystallin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CRYGB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CRYGB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de γB-crystallin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CRYGB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de γB-crystallin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie γB-crystallin dans les cellules tumorales présentant une expression de CRYGB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.