Plasmide CRISPR d'Activation (h) β ig-h3: sc-403770-ACT

TGFBI code pour β ig-h3 (TGFBIp), une protéine sécrétée de la matrice extracellulaire induite par la signalisation du TGF-β, qui module l’adhérence cellule–matrice, la migration et le remodelage tissulaire via des interactions avec les intégrines et des matrices riches en collagène. Elle contribue à l’organisation de la MEC, à la dynamique des adhésions focales et à des voies en aval liées à la transition épithélio-mésenchymateuse et à la réparation des plaies. Une expression dérégulée de TGFBI a été associée à des processus liés à la fibrose et au remodelage du microenvironnement tumoral, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la motilité cellulaire, de l’invasion et du dialogue stroma–épithélium. De plus, des variants de TGFBI et une altération du dépôt protéique sont impliqués dans des dystrophies cornéennes et d’autres phénotypes dépendants de la MEC.

β ig-h3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TGFBI sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β ig-h3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TGFBI dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TGFBI, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β ig-h3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TGFBI natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β ig-h3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β ig-h3 dans les cellules tumorales présentant une expression de TGFBI silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.