β-glucuronidase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404187-ACT

GUSB kodiert die menschliche β-Glucuronidase, eine lysosomale Hydrolase, die beim Abbau von Makromolekülen β-D-Glucuronsäurereste von Glykosaminoglykanen und anderen glucuronidhaltigen Substraten abspaltet. Durch die Unterstützung des lysosomalen Katabolismus und des mit Autophagie verknüpften Recyclings trägt die β-Glucuronidase zur zellulären Homöostase bei und beeinflusst Signalwege, die mit dem Umbau der extrazellulären Matrix sowie dem endolysosomalen Transport zusammenhängen. Ein Verlust der GUSB-Aktivität stört den Abbau von Glykosaminoglykanen und ist mit Mukopolysaccharidose Typ VII (Sly-Syndrom) assoziiert, wodurch GUSB für die Untersuchung der Biologie lysosomaler Speicherkrankheiten und der Proteostase relevant ist. GUSB wird zudem häufig als Referenz-enzym für lysosomale Assays zur Beurteilung der Lysosomenfunktion, des Enzymtraffickings und lysosomaler Stressantworten verwendet.

β-glucuronidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GUSB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

β-glucuronidase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GUSB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GUSB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen β-glucuronidase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GUSB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von β-glucuronidase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des β-glucuronidase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GUSB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.