β1 Tubulin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400113-ACT

TUBB1 kodiert β1-Tubulin, eine in Thrombozyten und Megakaryozyten angereicherte β‑Tubulin‑Isoform, die mit α‑Tubulin zu Mikrotubuli polymerisiert und damit die Organisation des Zytoskeletts, den intrazellulären Transport sowie die Dynamik der mitotischen Spindel unterstützt. In hämatopoetischen Zellen trägt β1‑Tubulin zur Ausstülpung von Prothrombozyten und zur Thrombozytenbiogenese bei, indem es den Aufbau von Mikrotubuli und die Bildung des marginalen Bandes reguliert. Mikrotubuliabhängige Prozesse, die durch die Tubulindynamik gesteuert werden, greifen in Signalwege der Zellzyklusprogression, des Vesikeltransports und des zytoskelettalen Umbaus ein. Genetische Veränderungen von TUBB1 wurden mit Auffälligkeiten der Thrombozytengröße und -zahl in Verbindung gebracht, wodurch es sich als nützliches Ziel für die Untersuchung der Thrombopoese und zytoskelettaler Störungen in humanen Zellmodellen eignet.

β1 Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TUBB1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

β1 Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TUBB1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TUBB1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen β1 Tubulin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TUBB1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von β1 Tubulin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des β1 Tubulin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TUBB1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.