XAF1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402427-ACT

XAF1 (XIAP-assoziierter Faktor 1) ist ein proapoptotischer Tumorsuppressor, der Proteine hemmt, die die Apoptose unterdrücken (IAPs), einschließlich XIAP, und dadurch die Caspase-Aktivierung sowie die mitochondriale Apoptose erleichtert. Seine Expression wird häufig durch Interferon-Signalwege und zellulären Stress induziert, was XAF1 mit angeborenen Immunantworten und transkriptionellen Programmen verknüpft, die das Überleben unter schädigenden Bedingungen begrenzen. Eine verminderte XAF1-Expression infolge von Promotor-Hypermethylierung oder transkriptioneller Repression wurde in zahlreichen Malignomen beschrieben und ist oft mit Apoptoseresistenz sowie einer veränderten Sensitivität gegenüber Stress-Signalwegen assoziiert. Als Regulator von Zellschicksalsentscheidungen wird XAF1 häufig im Kontext der Zellzykluskontrolle, von DNA-Schadensantworten und der Wechselwirkungen entzündlicher Signalwege untersucht.

XAF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen XAF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

XAF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des XAF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der XAF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen XAF1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native XAF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von XAF1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des XAF1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem XAF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.