WT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400095-ACT

WT1 (Wilms tumor 1) codifica un fattore di trascrizione a dita di zinco che regola le decisioni sul destino cellulare durante lo sviluppo embrionale e l’omeostasi tissutale, con ruoli di primo piano nella nefrogenesi, nello sviluppo delle gonadi e nella differenziazione del mesotelio. WT1 modula programmi trascrizionali che controllano proliferazione, apoptosi, transizioni epitelio-mesenchimali e specificazione di linea, interfacciandosi con vie quali Wnt/β-catenina, la segnalazione TGF-β e reti responsibili ai fattori di crescita. Nella biologia umana, un’alterata espressione di WT1 o mutazioni sono state associate a disturbi dello sviluppo e a diversi contesti oncologici, nei quali può agire in modo dipendente dal contesto come regolatore trascrizionale di insiemi di geni oncogenici o oncosoppressori. Queste caratteristiche rendono WT1 un nodo utile per studiare il rimodellamento delle reti trascrizionali, le traiettorie di differenziamento e la regolazione genica in risposta allo stress.

WT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

WT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di WT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da WT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via WT1 nelle cellule tumorali con espressione di WT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.