Wnt-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401418-ACT

WNT4 kodiert Wnt-4, einen sezernierten glykoproteinhaltigen Liganden, der über Wnt-Signalwege Entscheidungen über das Zellschicksal, Polarität, Migration und Differenzierung reguliert. Wnt-4 bindet an Frizzled/LRP-Rezeptoren und moduliert dadurch sowohl die β‑Catenin‑abhängige Transkription als auch nicht-kanonische Wnt/planare-Zellpolaritäts- und Ca2+-Signalwege, wodurch Entwicklungsprogramme und die Gewebehomöostase geprägt werden. In der menschlichen Biologie ist die WNT4-Aktivität eng mit der Entwicklung des Reproduktionstrakts und der Nieren verbunden und wurde zudem mit endokrinen und metabolischen Phänotypen in Zusammenhang gebracht; eine Fehlregulation der Wnt-Signalübertragung ist allgemein mit aberranter Proliferation, Fibrose und Tumorbiologie assoziiert. Diese Eigenschaften machen WNT4 zu einem hilfreichen Knotenpunkt, um Pathway-Crosstalk mit TGF‑β-, MAPK- und Hippo/YAP-Signalwegen in kontextspezifischen Modellen zu untersuchen.

Wnt-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WNT4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Wnt-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WNT4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WNT4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Wnt-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WNT4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Wnt-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Wnt-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WNT4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.