Plasmide CRISPR d'Activation (h) Wee 1: sc-400701-ACT

WEE1 code pour la tyrosine kinase nucléaire Wee1, un régulateur central du point de contrôle G2/M en réponse aux dommages de l’ADN, qui freine l’activité CDK1–cycline B par phosphorylation inhibitrice. En intégrant les signaux des voies ATR/CHK1 et de la réponse au stress de réplication, Wee1 coordonne la progression du cycle cellulaire avec l’achèvement de la réplication de l’ADN et sa réparation, contribuant ainsi à la stabilité du génome durant la phase S et la mitose. Une expression ou une activité dérégulée de WEE1 est fréquemment associée, en oncologie, à une altération du contrôle des points de contrôle, à une tolérance accrue au stress de réplication et à une instabilité chromosomique, et la protéine est également étudiée dans le contexte des réponses au stress génotoxique. Par conséquent, WEE1 est couramment investigué dans l’étude des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire, de la signalisation des dommages de l’ADN et des interactions synthétiques impliquant le statut de p53 et d’autres composants des points de contrôle.

Wee 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WEE1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Wee 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WEE1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WEE1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Wee 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WEE1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Wee 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Wee 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de WEE1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.