Wee 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400701-ACT

WEE1 kodiert die nukleäre Tyrosinkinase Wee1, einen zentralen Regulator des G2/M-DNA-Schadens-Checkpoints, der die CDK1–Cyclin-B-Aktivität durch inhibitorische Phosphorylierung bremst. Durch die Integration von Signalen aus den ATR/CHK1- und Replikationsstress-Signalwegen koordiniert Wee1 den Zellzyklusfortschritt mit dem Abschluss der DNA-Replikation und der Reparatur und unterstützt so die Genomstabilität während der S-Phase und der Mitose. Eine dysregulierte WEE1-Expression oder -Aktivität wird in der Krebsbiologie häufig mit veränderter Checkpoint-Kontrolle, erhöhter Toleranz gegenüber Replikationsstress und chromosomaler Instabilität in Verbindung gebracht und wird zudem im Kontext genotoxischer Stressantworten untersucht. Daher wird WEE1 häufig in Studien zu Mechanismen der Zellzykluskontrolle, DNA-Schadenssignalgebung und synthetischen Interaktionen – unter Einbeziehung des p53-Status und weiterer Checkpoint-Komponenten – untersucht.

Wee 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WEE1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Wee 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WEE1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WEE1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Wee 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WEE1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Wee 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Wee 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WEE1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.