Plasmide CRISPR d'Activation (h) WDR62: sc-410410-ACT

WDR62 code une protéine d’échafaudage contenant des répétitions WD, localisée aux centrosomes et aux pôles du fuseau, où elle coordonne l’organisation des microtubules et la progression mitotique. Elle est largement impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, la prolifération des progéniteurs neuronaux et la signalisation activée par le stress, avec des interactions rapportées au sein des réseaux de kinases mitotiques et des voies associées à JNK. En biologie humaine, WDR62 a été associé à des phénotypes neurodéveloppementaux et à des altérations de la différenciation neuronale, en accord avec des rôles dans la division symétrique/asymétrique et le développement cortical. Sa connectivité au sein des voies de signalisation en fait une cible utile pour disséquer les mécanismes de stabilité du génome, de fonction du centrosome et de contrôle de la prolifération dans des modèles cellulaires pertinents pour les maladies.

WDR62 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WDR62 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

WDR62 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WDR62 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WDR62, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de WDR62. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WDR62 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de WDR62 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie WDR62 dans les cellules tumorales présentant une expression de WDR62 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.