VAP-A Double Nickase Plasmid (h): sc-403093-NIC

VAPA kodiert VAP-A, ein im ER lokalisiertes, tail-anchored Membranprotein, das Membrankontaktstellen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und mehreren Organellen organisiert. Über seine MSP-Domäne bindet VAP-A FFAT-Motiv-Proteine, um Lipidtransfer, Phosphoinositidstoffwechsel, Vesikeltransport und die ER-Homöostase zu koordinieren – mit nachgelagerten Effekten auf Prozesse wie Autophagie und Stresssignalgebung. Von VAP-A abhängige ER-Kontaktnetzwerke beeinflussen die Verteilung von Cholesterin und Sphingolipiden und unterstützen die Funktion des sekretorischen Weges; damit wird eine Störung von VAPA mit zellulären Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Studien zu Neurodegeneration, metabolischer Dysregulation und Pathogenreplikation relevant sind. Als Gerüstprotein an interorganellären Kontaktstellen wird VAP-A häufig genutzt, um Mechanismen der Organellenkommunikation, des Lipidflusses und der Proteostase unter physiologischen Bedingungen und bei Stress zu untersuchen.

VAP-A Das Double-Nickase-Plasmid (h) besteht aus einem aufeinander abgestimmten Plasmidpaar, das für die hochspezifische Bearbeitung des VAPA-Lokus in human-Zelllinien entwickelt wurde. Jedes Plasmid exprimiert eine Cas9-D10A-Nickase und eine spezifische sgRNA, die auf entgegengesetzte DNA-Stränge innerhalb von VAPA abzielt. Wenn sie auf benachbarte Stellen auf entgegengesetzten DNA-Strängen gerichtet sind, erzeugen die beiden Nickasen versetzte Einzelstrang-Schnitte, die zusammen einen versetzten Doppelstrangbruch erzeugen, was eine koordinierte On-Target-Aktivität beider Guides erfordert. Der resultierende DNA-Bruch wird durch endogene zelluläre Reparaturwege behoben, meist durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ), was zu Insertionen oder Deletionen führt, die die VAPA-Funktion stören. Durch die Notwendigkeit einer doppelten sgRNA-Bindung am Zielort erhöht der Doppel-Nick-Ansatz die Spezifität der Bearbeitung und bietet eine komplementäre CRISPR-Strategie für Anwendungen, bei denen eine zusätzliche Kontrolle über die Zielgenauigkeit gewünscht ist.

Um eine effiziente Identifizierung editierter Zellen zu unterstützen, kodiert ein Plasmid GFP zur fluoreszierenden Visualisierung transfizierter Populationen, während das Begleitplasmid ein Puromycin-Resistenzgen für die Antibiotika-Selektion trägt. Zusammen unterstützen diese Merkmale eine effiziente Anreicherung co-transfizierter Populationen und vereinfachen die Validierung von Klonen mit VAPA-Störung.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.