Plasmide CRISPR d'Activation (h) VAP-A: sc-403093-ACT

VAPA code la protéine associée aux protéines membranaires des vésicules A (VAP-A), un adaptateur résident du RE qui organise les sites de contact membranaires et coordonne les échanges lipidiques, le trafic vésiculaire et la communication entre organites. VAP-A se lie à des partenaires contenant un motif FFAT afin de réguler l’homéostasie des phosphoinositides et des stérols, soutenant le transport RE–Golgi, la dynamique des endosomes et la signalisation RE–mitochondries. Par ces processus, VAP-A influence la protéostase, l’autophagie et les réponses au stress qui façonnent le métabolisme et la survie cellulaires. La dérégulation de la biologie des sites de contact liée à VAPA a été impliquée dans les maladies neurodégénératives et d’autres troubles associés à une altération de la gestion des lipides et au stress du RE, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques de l’organisation membranaire.

VAP-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VAPA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VAP-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VAPA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VAPA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VAP-A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VAPA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VAP-A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VAP-A dans les cellules tumorales présentant une expression de VAPA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.