Plásmido CRISPR de Activación (h) V-ATPase D1: sc-403669-ACT

ATP6V0D1 codifica la subunidad D1 de la ATPasa de protones de tipo V (V-ATPasa) del sector de membrana V0, un componente central de la bomba rotatoria de protones que acidifica endosomas, lisosomas y otros orgánulos intracelulares. Mediante la acidificación de los orgánulos, la actividad de la V-ATPasa favorece la endocitosis mediada por receptores, la proteólisis lisosomal, la autofagia y el tráfico vesicular, y contribuye a la homeostasis del pH en múltiples tipos celulares. El ensamblaje correcto de la V-ATPasa y la translocación de protones también son importantes para las plataformas de señalización endolisosomal, incluidas vías que dependen de la función lisosomal, como la detección de nutrientes por mTORC1. La desregulación de la acidificación y el tráfico endolisosomal se asocia con neurodegeneración, respuestas inmunitarias alteradas y fenotipos de invasión vinculados al cáncer, lo que convierte a ATP6V0D1 en un objetivo relevante para estudios mecanísticos de la función de los orgánulos.

V-ATPase D1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP6V0D1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

V-ATPase D1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP6V0D1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP6V0D1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de V-ATPase D1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP6V0D1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de V-ATPase D1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía V-ATPase D1 en células tumorales con expresión de ATP6V0D1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.